目前最常用的分离方法是利用脂肪抽吸术，将得到的脂肪组织，用D-Hank′s液反复冲洗，剪碎。用预温的0.1%I型胶原酶37℃，消化1h。100目筛网过滤除去未消化的组织。将滤出液置入离心管中，1000r/min，室温离心10min，弃上清。用D-Hank′s液重悬洗涤，反复2-3次，以除去I型胶原酶，离心，弃去上清，并用移液管反复吹打，使之成为单细胞悬液，计数，以1~2×10⁶/ml的接种密度接种于DMEM_LG+10%FBS培养液中，置37℃，5%CO₂的饱和湿热培养箱培养。接下来2天，每天换液一次，并用PBS轻轻洗涤，弃去组织块和未贴壁的细胞，以后每3天换液一次。当细胞达80%-90%融合时，0.25%胰酶(含0.02%的EDTA)常规消化，进行传代。

1g脂肪组织约可分离得到5000个CFU-F，利用脂肪抽吸术，每200ml脂肪组织可得到1×10⁶个脂肪干细胞。它们对培养基中胎牛血清的来源和质量没有严格要求，并且直至培养13-15代仍可保持稳定的倍增率，其中衰老和死亡细胞所占的比例也很少。

 

脂肪干细胞在脂肪组织的血管周围比较集中，同时可以分泌多种细胞因子，保持了其在结构与功能上的稳定。利用组织块消化及贴壁法从脂肪抽吸物中分离得到的脂肪干细胞，同时也混杂有其他的细胞，如血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、血细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和其他成纤维细胞等，然而经过分离培养后，贴附在培养皿底部、形似成纤维细胞且经多代培养不易衰老的细胞，即脂肪干细胞。脂肪干细胞的获取量和分化能力不仅受供者年龄的影响，而且取材部位与手术方式的不同也有所区别。供体者的年龄是影响脂肪干细胞增生能力的一大因素，供者的年龄越小，细胞的增生能力越强，反之，则越差；来源于不同部位的脂肪干细胞凋亡倾向也不同，如腹部的脂肪干细胞不容易凋亡；利用脂肪抽吸术得到的脂肪干细胞不会影响其活性，只是吸管的粗细会影响脂肪颗粒的大小，进而影响分离的难易程度，但有超声辅助的抽脂术获取的脂肪干细胞增殖能力会有所降低。

 

脂肪组织在人体中大量存在，容易获取，失去后对被采集者的影响较小，并且真空负压抽脂术是目前整形外科一项成熟的技术，因此相对于其他干细胞，脂肪干细胞的获取相对较易，从而也大大提升了其应用的潜力。